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Fonte: https://www.ansa.it/...596ff292f5.html
 
Fatica cronica, un prelievo per la diagnosi. Sviluppato il test basato sull'intelligenza artificiale, ha il 91% di accuratezza

ROMA, 13 settembre 2023, 10:41
Redazione ANSA
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Traduzione automatica della pubblicazione:
https://onlinelibrar.../advs.202302146
 



Sviluppo di un test diagnostico basato sulle cellule del sangue per l'encefalomielite mialgica/sindrome da stanchezza cronica utilizzando cellule mononucleari del sangue periferico
 
Jiabao Xu, Tiffany Loggia, Carolina Kingdon, James WL Forte, Giovanni Maclennan, Eliana Lacerda, Slawomir Kujawski, Pawel Zalewski, Wei E. Huang, Karl J.Morten

Pubblicato per la prima volta:31 agosto 2023

Estratto

L'encefalomielite mialgica/sindrome da stanchezza cronica (ME/CFS) è caratterizzata da un affaticamento debilitante che ha un profondo impatto sulla vita dei pazienti. La diagnosi di ME/CFS rimane difficile, con la maggior parte dei pazienti che si affida ad auto-segnalazioni, questionari e misure soggettive per ricevere una diagnosi, e molti non ricevono mai una diagnosi chiara. In questo studio, una piattaforma Raman a cellula singola e l’intelligenza artificiale vengono utilizzate per analizzare le cellule del sangue di 98 soggetti umani, inclusi 61 pazienti ME/CFS di varia gravità della malattia e 37 controlli sani e malati. Questi risultati dimostrano che i profili Raman delle cellule del sangue possono distinguere tra individui sani, controlli della malattia e pazienti con ME/CFS con elevata precisione (91%) e possono ulteriormente differenziare tra pazienti con ME/CFS lieve, moderata e grave (84%) . Inoltre, vengono identificati picchi Raman specifici che sono correlati ai fenotipi ME/CFS e che hanno il potenziale per fornire approfondimenti sui cambiamenti biologici e supportare lo sviluppo di nuove terapie. Questo studio presenta un approccio promettente per aiutare nella diagnosi e nella gestione della ME/CFS e può essere esteso ad altre malattie croniche inspiegabili come il COVID lungo e la sindrome della malattia di Lyme post-trattamento, che condividono molti degli stessi sintomi della ME/CFS.

1. Introduzione
L’encefalomielite mialgica/sindrome da stanchezza cronica (ME/CFS) è una malattia complessa con eziologia sconosciuta. Poiché la caratteristica distintiva della malattia è l'affaticamento, la ME/CFS presenta un'ampia gamma di sintomi che variano da paziente a paziente e possono fluttuare nel tempo. Questi sintomi includono spesso malessere post-sforzo (PEM), disfunzione cognitiva, disturbi del sonno, intolleranza ortostatica, regolazione termica anormale, mialgia, fotosensibilità e disfunzione neuro-immuno-endocrina, [1] che si traducono in una significativa riduzione dei pazienti . ' qualità della vita. Tra tutti i fattori scatenanti identificati per la ME/CFS, fino al 75% dei casi riporta episodi di infezione che precedono l’esordio della loro condizione. [ 2 ]Anche altri fattori, come i principali eventi di stress e l’esposizione a sostanze chimiche, sono stati riconosciuti come potenziali contributori. [ 3 ] La suscettibilità del paziente, influenzata da fattori genetici o dall'anamnesi medica, potrebbe essere vitale nella sua risposta atipica a un fattore scatenante stressante, passando così dalla tipica risposta infiammatoria immunitaria transitoria a uno stato persistente e cronico. Circa il 70% dei pazienti ME/CFS sono donne. Le femmine hanno una risposta più forte alle infezioni o alle vaccinazioni rispetto ai maschi, e si propone che le differenze negli ormoni sessuali svolgano un ruolo nella prevalenza delle malattie autoimmuni, inclusa la ME/CFS. [ 4 ]Inoltre, il microbioma può essere essenziale, poiché microbioti diversi sono stati associati a profili ormonali diversi nei maschi e nelle femmine. [ 5 ] Le prove suggeriscono anche una funzione cerebrale anormale nella ME/CFS, con l'attivazione microgliale studiata direttamente o indirettamente collegata ai cambiamenti metabolici e all'infiammazione. [ 6 ]
Recentemente, molti pazienti affetti da COVID-19 hanno sviluppato la sindrome del Long Covid o del Long Hauler, [ 7 - 9 ] che può essere classificata come ME/CFS se irrisolta dopo sei mesi e se soddisfa i criteri IOM per la ME/CFS, che impongono una PEM componente. [ 10 ] Ci sono oltre 250.000 casi di ME/CFS segnalati nel Regno Unito e si prevede che questo numero aumenterà in modo significativo a causa della prevalenza del COVID lungo con circa 50-100 milioni di casi stimati in tutto il mondo. [ 2 , 11 , 12 ]
La ME/CFS non dispone di un singolo test diagnostico sensibile e specifico, [ 13 ]rendendo lo sviluppo di un test semplice con il potenziale per la diagnosi precoce un obiettivo fondamentale. La diagnosi precoce consentirebbe ai pazienti di gestire le loro condizioni in modo più efficace, portando potenzialmente a nuove scoperte sui percorsi della malattia e sullo sviluppo del trattamento. Dato che la maggior parte dei casi di ME/CFS vengono identificati tramite sintomi e questionari, l’esclusione di diagnosi alternative è vitale. I biomarcatori basati sul sangue possono rivelarsi utili per diagnosticare rapidamente e accuratamente la ME/CFS integrando gli attuali set di indicatori misurati durante i controlli medici di routine. Inoltre, i marcatori derivati ​​dal sangue possono aiutare a differenziare disturbi simili, come la ME/CFS, la sclerosi multipla (SM), la fibromialgia, la malattia cronica di Lyme e il Long Covid. [ 2 ]I prelievi di sangue potrebbero anche fornire approfondimenti longitudinali sulla risposta al trattamento per la ME/CFS e sull’insorgenza di sintomi più gravi. Nel complesso, lo sviluppo di un test singolo e oggettivo basato sul sangue sarebbe un passo significativo verso il miglioramento della diagnosi e della gestione della ME/CFS.
Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) e le biopsie muscolari ottenute da pazienti ME/CFS hanno mostrato una funzione mitocondriale alterata, indicando una differenza nella funzione energetica rispetto ai controlli non affaticati. [ 14 - 16 ] Ricerca di Missailidis et al. hanno scoperto che quando i linfociti dei pazienti ME/CFS venivano immortalati, generavano linee cellulari con proprietà energetiche molto diverse. [ 17 ]Poiché la ME/CFS può avere un problema energetico sistemico, lo studio delle PBMC può fornire un buon modello per comprendere la patologia che colpisce altri sistemi di organi. Con le prove che suggeriscono differenze nelle frazioni di cellule del sangue dei pazienti ME/CFS, abbiamo ipotizzato che l'analisi di singole cellule delle PBMC potrebbe rivelare differenze nella ME/CFS rispetto ai gruppi sani e ad altri gruppi affetti da malattie. In questo studio, abbiamo incluso i pazienti con SM come gruppo di controllo della malattia. La ME/CFS e la SM sono due condizioni distinte con molti sintomi clinici simili. Una delle differenze chiave tra le condizioni è che la SM è associata a chiari cambiamenti patologici nel cervello ed è considerata dalla professione medica come una vera malattia [ 18 ]mentre la ME/CFS è ancora vista con scetticismo da molti, senza opzioni di trattamento efficaci o una patologia chiara.
La spettroscopia Raman è un approccio non invasivo e privo di etichette per sondare le vibrazioni molecolari in un campione e, se combinato con la microscopia confocale, può interrogare singole cellule. [ 19 ] Uno spettro Raman a cellula singola (SCRS) è un'impronta digitale fenotipica di tutte le biomolecole in quella cellula e potrebbe potenzialmente differenziare tra vari tipi di cellule e fornire informazioni sulla biologia sottostante. [ 19 ] Il nostro precedente studio pilota ha dimostrato che un confronto tra SCRS potrebbe distinguere tra pazienti ME/CFS e controlli sani, e ha identificato un potenziale biomarcatore PBMC per la ME/CFS. [ 20 ]Qui, abbiamo sviluppato il nostro studio pilota e valutato ulteriormente il potenziale diagnostico di una piattaforma basata sul sangue utilizzando la spettroscopia Raman a cellula singola e modelli di classificazione dell’apprendimento d’insieme all’avanguardia per discriminare la ME/CFS da due gruppi di controllo. Abbiamo anche valutato la capacità dell’approccio di differenziare tra diversi gruppi di gravità della malattia ME/CFS, inclusi lieve, moderata e grave. Dato che le PBMC sono un obiettivo facilmente accessibile, crediamo che la spettroscopia Raman combinata con l’intelligenza artificiale avanzata potrebbe offrire uno strumento di screening conveniente e non invasivo per la ME/CFS quando la condizione viene identificata per la prima volta.

2.1 Disegno dello studio su soggetti umani e caratteristiche cliniche
Il nostro precedente studio pilota su 10 individui ha illustrato la capacità della spettroscopia Raman a cellula singola e degli approcci di apprendimento automatico nel trovare biomarcatori specifici nei PBMC dei pazienti ME/CFS. [ 20 ] Abbiamo ora ampliato il nostro approccio a una coorte più ampia come test diagnostico spettroscopico Raman basato sul sangue a livello di singola cellula. La Tabella S1 (Informazioni di supporto) riassume le caratteristiche chiave della coorte ME/CFS e dei controlli sani (HC) e malati (MS) coinvolti in questo studio. In totale, sono stati coinvolti 98 soggetti umani, inclusi 61 ME/CFS e 37 controlli (HC, n = 16; MS, n = 21). In base ai loro profili clinici. La coorte ME/CFS è stata ulteriormente divisa in Grave ( n= 21), Moderato ( n = 15) e Lieve ( n = 25).
Tutti i pazienti nei gruppi con affaticamento (ME/CFS e MS) hanno avuto affaticamento per almeno sei mesi che non è stato alleviato dal riposo. Tutti i pazienti con SM avevano una diagnosi di SM fornita da un consulente del Servizio Sanitario Nazionale [ 21 ]e quelli reclutati erano un misto di forme recidivanti, remittenti e progressive. Quelli con ME/CFS necessitavano di una precedente diagnosi medica di ME/CFS. Per essere accettati come partecipanti affetti dalla ME/CFS, i potenziali donatori devono soddisfare i Criteri di Consenso Canadesi o i criteri CDC-1994; molti soddisfano entrambi. Il processo di valutazione della conformità ai criteri di studio comprende questionari di base sui sintomi, una valutazione clinica eseguita da un membro clinico del gruppo di ricerca, screening delle analisi delle urine ed esami del sangue di base, che vengono utilizzati per escludere diagnosi alternative. Interrogazioni dettagliate sui potenziali partecipanti con la ME/CFS consentono di classificare la loro malattia secondo diverse definizioni di caso. I casi di ME/CFS venivano classificati come lievi se avevano un punteggio SF-36 sulla Funzione Fisica (PF) maggiore di 25; moderato se il punteggio PF era inferiore a 25; e grave se erano costretti a casa o a letto, con tutti i pazienti identificati come affetti da PEM.
I livelli di affaticamento dei pazienti ME/CFS, con SM e dei controlli sani sono stati misurati mediante misure cliniche della Fatigue Severity Scale (FSS). [ 22 ] Il General Health Questionnaire (GHQ) [ 23 ] è stato utilizzato principalmente come strumento di screening per escludere pazienti che soffrono di depressione grave ed è già stato utilizzato a questo scopo in un precedente studio sulla ME/CFS utilizzando i criteri Fukuda del 1994. [ 24 ] I valori FSS mediani potrebbero distinguere i pazienti ME/CFS e MS dai controlli sani; ME/CFS: 59 (intervallo 44–63); SM: 54 (intervallo 16-63); HC 17 (intervallo 11–37) (Tabella S1, Informazioni di supporto). Tuttavia, la valutazione della FSS non ha potuto separare facilmente i pazienti ME/CFS dai pazienti con SM né tra le diverse gravità della ME/CFS ( p = 0,07). Utilizzando ulteriori misure cliniche registrate dalla biobanca ME/CFS del Regno Unito durante il reclutamento, abbiamo studiato la loro utilità nel discriminare la ME/CFS dai controlli della malattia con SM e dai controlli sani, producendo una valutazione del carico dei sintomi (Tabella S2, Informazioni di supporto ) . L'inclusione delle caratteristiche dei sintomi è stata determinata calcolando l'intensità ordinale media relativa per ciascuna variabile per fornire dettagli sufficienti per classificare i sintomi (in contrapposizione a un numero intero derivato dalla mediana con rappresentazione categoriale), consentendo l'inclusione selettiva con una differenza > 1,5 volte tra i gruppi (ME grave rispetto alla SM). Figura 1 riassume i sintomi in una mappa termica che mostra le 28 principali variabili cliniche (Figura  1 ). Una chiara differenza è stata osservata confrontando i pazienti HC con i pazienti ME/CFS e MS. Un aumento nella gravità dei sintomi è stato osservato quando si passava da pazienti ME/CFS da lievi a gravi. Le misure più significative valutate dal test esatto di Fischer sono state calcolate sulla base del confronto tra ME grave e SM, con la procedura Benjamini-Hochberg (BH) applicata per aggiustare confronti multipli (* p < 0,05 )  .



Figura 1


Caratteristiche cliniche della coorte ( n = 98). La presenza e l'intensità dei sintomi sono state determinate per 63 variabili ottenute dalla valutazione dei sintomi dell'UKMEB. Le risposte sono state registrate su una scala ordinale a 4 punti, dove 0 indicava "assente", 1 indicava "lieve", 2 indicava "moderato" e 3 indicava "grave"; le caselle grigie indicano i dati mancanti. L'inclusione nella categoria è stata determinata calcolando il peso/intensità ordinale medio relativo per ciascuna variabile, con una differenziazione tra gruppi (ME grave rispetto a MS come gruppo di riferimento) ≥ 1,5 richiesta per l'inclusione analitica. Inoltre, è stato calcolato il test esatto di Fischer per il confronto tra ME grave e SM, con la procedura Benjamini-Hochberg (BH) applicata per aggiustare confronti multipli (sig. p  < 0,05).

2.2 Gli SCRS differenziano le diverse coorti
Per prima cosa abbiamo utilizzato un approccio semplice esaminando la fosforilazione ossidativa mitocondriale in PBMC congelate vitali da 41 dei 98 soggetti. Un precedente rapporto di Tomas et al. ha mostrato una differenza nella respirazione mitocondriale dell'intera cellula, coerente con una carenza di energia cellulare associata alla disfunzione mitocondriale o al flusso di substrato che si alimenta nel ciclo TCA e nella catena respiratoria mitocondriale. [ 16 ] Tuttavia, questo test era difficile da riprodurre; Missailidis et al. non sono riusciti a riprodurre questo risultato nei PBMC ma hanno riscontrato differenze nei linfociti zimortalizzati. [ 25 ]Nel nostro studio, la vitalità cellulare dopo lo scongelamento era compresa tra il 70% e l'85% con un notevole calo della vitalità dopo 24 ore di coltura. La respirazione mitocondriale è stata misurata in un mezzo di glucosio da 5 mm con frequenze misurate nell'arco di 1-2 ore. Non è stata osservata alcuna differenza nei tassi di respirazione mitocondriale tra pazienti ME/CFS, pazienti con SM e controlli sani (Figura S1A , Informazioni di supporto). Quando i pazienti ME/CFS sono stati divisi in pazienti gravi, moderati e lievi, non è stata osservata alcuna differenza (Figura S1B, Informazioni di supporto). Ciò ha dimostrato che la valutazione della funzione mitocondriale delle PBMC utilizzando un test del consumo di ossigeno su campioni congelati crioconservati non è riuscita a discriminare le coorti di malattie e sarà difficile sviluppare un approccio diagnostico robusto.
Poiché una semplice valutazione della funzione mitocondriale non è riuscita a differenziare diverse coorti, abbiamo quindi cercato di utilizzare la spettroscopia Raman a singola cellula per ottenere interi profili molecolari a singola cellula sugli stessi campioni. I PBMC di 98 individui sono stati misurati mediante spettroscopia Raman a cellula singola con spettri Raman a cellula singola (SCRS) acquisiti su singoli PBMC. In totale, abbiamo ottenuto 14.600 spettri da 2.155 singole cellule. Tutte le misurazioni Raman sono state effettuate in cieco in questo studio. La Figura  2A presenta l'SCRS medio di singoli PBMC dalle coorti HC (numero di cellule = 410), ME/CFS (numero di cellule = 1151) e MS (numero di cellule = 594) nella regione delle impronte digitali (300–1800 cm −1). La regione dell'impronta digitale contiene la maggior parte delle informazioni provenienti dalle vibrazioni molecolari intrinseche all'interno di una cellula e pertanto può essere considerata come un'“impronta digitale” di una cellula. La fluttuazione da cellula a cellula è stata rappresentata come deviazione standard per ciascun numero d'onda, disegnata come area ombreggiata nella Figura  2A. La somma della fluttuazione è stata del 21,7%, 19,7% e 17,1% rispettivamente in HC, ME/CFS e MS. Le elevate fluttuazioni nei controlli sani potrebbero essere dovute alla prevalenza di altri fattori che non erano criteri di ME/CFS o MS ma potrebbero contribuire ai cambiamenti nelle cellule immunitarie nella popolazione di fondo, per esempio, infezioni esistenti, stress, o stili di vita diversi. Le cellule nelle coorti ME/CFS differivano più di quelle nelle coorti MS in termini di profili metabolici, probabilmente a causa di un numero più elevato di soggetti coinvolti e dell’ampia gamma di gravità dei sintomi da lieve, moderata e grave. Allo stesso modo, la SCRS media per i sottogruppi ME/CFS di Lieve, Moderato e Grave è illustrata nella Figura  2B . Figura  2Cdimostra la differenza di spettri tra ME/CFS e HC, così come tra MS e HC. Oltre a differire dai controlli sani, le due coorti di malattie hanno mostrato anche una serie di differenze spettrali l’una dall’altra.



figura 2

Il SCRS differisce tra le diverse coorti ( n= 98). Spettri Raman medi di 2155 singole cellule ottenute da 98 soggetti individuali, separando in A) tre gruppi di HC, ME e MS, o cinque gruppi di HC, ME lieve, ME moderata, ME grave e MS. C) Differenze tra spettri di ME e HC e MS e HC; linea verde: linea di base HC sottratta. Gli spettri Raman di ciascun gruppo sono stati spostati in intensità per facilitare la visualizzazione e l'intensità è espressa in unità arbitrarie (au). D–I) Il clustering LDA è stato utilizzato per visualizzare le separazioni tra tre gruppi di HC, ME e MS a livello di singola cellula e a livello individuale, quattro gruppi di HC e diversi gruppi di ME (lieve, moderata e grave) a livello a livello di singola cellula e a livello individuale e cinque gruppi di HC, diversi gruppi di ME (lieve, moderato e grave) e SM a livello di singola cellula e a livello individuale.

L'analisi discriminante lineare supervisionata (LDA) è stata utilizzata per ridurre il rumore e l'elevata dimensionalità degli spettri Raman a causa della presenza di 1019 numeri d'onda Raman (intervallo spettrale da 319 a 3401 cm −1; dimensione del passo spettrale di ≈3 cm −1 ) . Un grafico LDA di tutti gli SCRS di 2155 cellule lungo LD1 e LD2 illustra tre cluster chiaramente separabili che rappresentano HC, ME/CFS e MS (Figura  2D). Il LD1, che spiega il 63% della varianza dei dati, separa la coorte SM dai controlli sani e dalla coorte ME/CFS, mentre LD2 spiega il restante 37% di varianza e separa la coorte ME/CFS dalle altre. Oltre alla visualizzazione utilizzando singole cellule, la visualizzazione LDA è stata quindi condotta a livello individuale mostrando 98 soggetti come tre cluster distinti per HC, ME e MS (Figura  2E ). Per confrontare solo le coorti HC con quelle ME/CFS, la LDA è stata eseguita su quattro gruppi: HC e i 3 sottogruppi ME/CFS. Curiosamente, un grafico LDA di tutte le SCRS separa nuovamente i sottogruppi HC e ME dove l'asse lungo LD1 (52% della varianza) distingue tutte le coorti ME dai controlli sani e LD2 (31% della varianza) rivela la divisione dei cluster di malattie di grado lieve e gruppi di grado moderato e grave (Figura 2F ). La media della SCRS per gli individui chiarisce bene le differenze tra soggetti HC e gruppi di malattie ME con diversa gravità di lieve, moderata e grave (Figura  2G ). Una LDA con tutti e cinque i gruppi mostra cluster distinti di HC e ME grave, mentre, cosa interessante, una sovrapposizione di ME/CFS lieve e moderata e MS (Figura  2H ). L'LDA dei cinque gruppi a livello tematico mostra anche la separazione di diversi sottogruppi (Figura  2I ). La trasferibilità della separazione a livello cellulare a livello del soggetto ha fornito supporto per l'ulteriore sviluppo di questo approccio in uno strumento diagnostico. Nel complesso, i dati della LDA a tre, quattro e cinque gruppi mostrano il potere di differenziazione sottostante all’interno del SCRS per le malattie da affaticamento come la ME/CFS e la SM.
Abbiamo quindi valutato possibili fattori confondenti che avrebbero potuto influenzare le separazioni delle LDA delle diverse coorti, tra cui sesso, indice di massa corporea (BMI), età, durata della malattia, tipi e conteggi totali di farmaci e integratori, nonché durata e trattamento del congelamento. tempo per ciascun campione (Tabella S3, Informazioni di supporto). I coefficienti di correlazione di Pearson sono stati ottenuti da coppie di variabili; la correlazione più alta per quanto riguarda i valori LD1 è stata –0,24 (classe di farmaci oppiacei presenti) e la correlazione più alta contro LD2 è stata –0,27 (classe di farmaci triciclici o mirtazapina presenti), entrambi ben al di sotto della definizione di correlazione elevata (>0,75) . La bassa correlazione tra i valori di classificazione e tutti i potenziali fattori di confusione illustra la robustezza del set di dati Raman nel trascurare le differenze di base ed evidenziare gli effetti della malattia.

2.3 Quantificazione di biomolecole in diverse coorti
L'LDA è stato utilizzato anche come strumento di selezione delle caratteristiche per trovare le caratteristiche del picco Raman più significative che contribuiscono alla separazione del gruppo. La quantificazione dei picchi significativi rispetto a diversi gruppi di HC, ME/CFS e MS ha evidenziato i diversi componenti biologici nelle cellule di individui sani e pazienti affetti da affaticamento. Le caratteristiche dei picchi Raman principali selezionate in base al clustering LDA sono state quantificate a singoli numeri d'onda per i gruppi HC, ME/CFS e MS, rispettivamente, sia a LD1 che a LD2 (Tabella S4, Informazioni di supporto ) .
In seguito al nostro studio pilota che ha trovato la fenilalanina come potenziale biomarcatore nei PBMC dei pazienti ME/CFS, tra le principali caratteristiche Raman nella Tabella S4 (Informazioni di supporto), abbiamo evidenziato la quantificazione relativa degli amminoacidi aromatici (AAA) tra le coorti, vale a dire il triptofano ( Figura  3A ), tirosina (Figura  3B ) e fenilalanina (Figura  3C ) integrando e quantificando le bande Raman associate. Un aumento universale di triptofano e tirosina nelle PBMC cellulari è stato osservato in tutte le coorti di malattie, inclusi in tutti i sottogruppi di ME/CFS e nel gruppo MS (Figura  3A,B). Differenze significative tra i gruppi sono state riscontrate in tutti i gruppi rispetto ai controlli sani, ad eccezione del sottogruppo ME/CFS lieve. La quantificazione della fenilalanina intracellulare, d'altra parte, suggerisce sottotipi metabolici esistenti nei pazienti con ME, con i gruppi moderati e gravi che hanno ridotto significativamente la fenilalanina e quelli con ME e MS lievi che hanno livelli aumentati rispetto ai controlli. Oltre agli aminoacidi è stato riscontrato anche un metabolismo lipidico alterato (Figura  3D-F ). Tutte le coorti di malattie avevano livelli di glicerolo significativamente elevati rispetto ai controlli sani (Figura  3D ). Sono state osservate alterazioni incoerenti dei lipidi insaturi con livelli elevati nei pazienti con ME lieve e con SM e livelli ridotti nei pazienti con ME moderata e grave (Figura  3E), suggerendo una differenza nei profili lipidici di diverse coorti. Sono stati osservati livelli ridotti di colesterolo e di esteri del colesterolo, particolarmente evidenti nella coorte con SM (Figura  3F ). Anche le biomolecole legate al rifornimento energetico hanno dimostrato differenze tra i gruppi. I livelli di glicogeno erano significativamente ridotti nella coorte con ME lieve e grave, così come nel gruppo con SM. La quantificazione del glucosio ha mostrato una diminuzione in tutti i sottogruppi ME e la coorte MS ha avuto il più basso accumulo di glucosio (Figura  3H ).



Figura 3


Quantificazione relativa delle biomolecole nelle PBMC delle coorti HC, ME (lieve, moderata e grave) e MS ( n = 98), correlate agli amminoacidi aromatici (AAA) di A) triptofano a 758 cm −1 , tirosina a 860 cm −1 , e C) fenilalanina a 1003 cm −1 , metabolismo lipidico di D) glicerolo a 1114 cm −1 , E) acidi grassi insaturi (FA) a 3010 cm −1 e F) colesterolo/esteri del colesterolo (CE) a 617 cm −1 e metabolismo energetico di G) glicogeno a 485 cm −1 e H) glucosio a 405 cm −1. I risultati della quantificazione sono stati rappresentati come box plot e la media campionaria di ciascun gruppo di malattie è stata confrontata con il controllo sano (HC) utilizzando il t -test di Welch a due campioni per varianza disuguale (ns: non significativo; ** p  < 0,01; ** * p  < 0,001 e **** p  < 0,0001).


2.4 Un test diagnostico basato su cellule che utilizza SCRS di PBMC e un Ensemble Learner
Poiché l'LDA ha già dimostrato la sua capacità di separare bene diverse coorti di malattie, abbiamo quindi cercato di valutare le sue prestazioni come classificatore sulla diagnosi addestrando un modello di classificazione con l'80% dei dati spettrali e testando le prestazioni del modello utilizzando il restante 20% come un set di test indipendente. L'accuratezza della classificazione di cinque classi di SM, ME grave, ME moderata, ME lieve e HC è stata del 54,8% nel set di test e del 47,1% nel set di test (Tabella S5, Informazioni di supporto). Per migliorare ulteriormente il potere di differenziazione del modello, è stato utilizzato l’apprendimento d’insieme. L'apprendimento d'insieme è un approccio di apprendimento automatico che combina più algoritmi di classificazione per ottenere prestazioni migliori di quelle che potrebbero essere ottenute da qualsiasi algoritmo costituente da solo. È stato segnalato per l'ottenimento della massima prestazione predittiva ed è stato applicato in molte aree della diagnosi medica, dalle malattie neurodegenerative [ 26 , 27 ] e dal cancro [ 28 - 30 ] alla medicina rigenerativa per identificare la differenziazione delle cellule staminali. [ 31 ]Qui, abbiamo fornito il nostro SCRS a otto diversi modelli di classificazione, vale a dire LDA, XGB (extreme gradient boosting), SVM-Linear (supporto macchina vettoriale con un kernel lineare), SVM-Radial (supporto macchina vettoriale con un kernel di funzione base radiale), MLPNN (rete neurale perceptron multistrato monotune), RF (foresta casuale), MDA (analisi discriminante della miscela) e GBM (macchina per l'amplificazione del gradiente). Quindi, è stato utilizzato un GBM separato per mettere insieme gli output dei diversi classificatori e creare un insieme di studenti che ha fornito la diagnosi finale ( Figura  4 ). Dopo il ricampionamento, è stato riscontrato che gli otto classificatori individuali avevano basse correlazioni tra loro (Figura S2, Informazioni di supporto); pertanto, lo studente dell'insieme potrebbe trarre pieno vantaggio da diversi classificatori senza costi computazionali ripetitivi.



Figura 4


Illustrazione schematica del test diagnostico spettroscopico Raman basato sul sangue per la ME/CFS e la SM a livello di singola cellula. A) I PBMC sono stati isolati da campioni di sangue.  Sono stati misurati gli spettri Raman di singoli PBMC di 98 individui. C) In ciascuna cella sono stati misurati circa 5-7 spettri di cui è stata poi calcolata la media su uno spettro per una cella; Sono stati ottenuti ≈30 spettri per ciascuna cella. D) L'SCRS a livello di singola cellula di 98 individui è stato quindi suddiviso in un set di treni (80%) e un set di test (20%) con distribuzione bilanciata di sottogruppi. Il set di treni è stato utilizzato per formare uno studente insieme e il set di test indipendente è stato inserito nello studente addestrato per diagnosticare la cellula come HC, ME o MS.


La Figura  4 mostra il flusso di lavoro tecnico, spettroscopico e di apprendimento automatico di un test diagnostico basato su cellule del sangue utilizzando SCRS di PBMC e un modello di apprendimento automatico di apprendimento ensemble. Dopo l'isolamento delle PBMC dal sangue del paziente, le cellule vengono prelevate per l'esame spettroscopico Raman. Viene calcolata la media degli spettri a singola cellula da >5 spettri per cellula e inseriti nel modello di classificazione dell'apprendimento d'insieme addestrato per le diagnosi individuali. Le singole diagnosi vengono poi ulteriormente convertite tramite un modello GBM per fornire una diagnosi finale.
Lo studente di ensemble multi-modello ha mostrato prestazioni effettivamente molto migliori per il compito di previsione di cinque classi sul set di test indipendente ( Figura  5A ). L'accuratezza è stata significativamente migliorata dal 47% e 61% nei modelli individuali (Tabella S5 , Informazioni di supporto) all'83,8% nel modello d'insieme (Figura  5A ), dimostrando il maggiore potere predittivo del modello d'insieme combinando diversi algoritmi di apprendimento. Nello specifico, il modello d’insieme ha mostrato capacità nel differenziare sottogruppi di pazienti ME/CFS in base alla gravità dei sintomi. La sensibilità e la specificità sono dell'88% e del 95% per il lieve, dell'86% e del 98% per il moderato e del 71% e 97% per il grave (Figura  5A). Circa il 12% dei pazienti affetti da ME grave sono stati classificati come moderati o lievi, mentre l'11% è stato classificato come SM, suggerendo una somiglianza tra le due malattie, in particolare la SM e la ME/CFS con elevata gravità (Figura 5A  ) .



Figura 5


Combina le prestazioni degli studenti su un set di test indipendente suddiviso per A) cinque classi con una precisione complessiva dell'84% e tre classi con una precisione complessiva del 91%. Le voci della matrice vengono visualizzate come valori percentuali. Il modello di classificazione a tre classi mostra una prestazione nella diagnosi di ME/CFS con sensibilità del 91% e specificità del 93%, SM con sensibilità del 90% e specificità del 92%, e un'accuratezza complessiva al 91% con 87-93% con intervallo di confidenza al 95% .

Per una migliore rilevanza clinica sulla prospettiva predittiva, abbiamo anche esaminato le prestazioni dello studente insieme per i compiti di classificazione in tre classi, cioè classificare ogni spettro di singola cellula come MS, ME/CFS o HC (Figura  5B ) . Il modello ha raggiunto prestazioni elevate sul set di test indipendenti con una sensibilità del 91% e una specificità del 93% per il gruppo ME/CFS; una sensibilità del 90% e una specificità del 92% per il gruppo SM. L'accuratezza complessiva del set di test è stata del 91% (87-93% con un intervallo di confidenza del 95%) (Figura  5B ).
È importante evidenziare che il nostro approccio è stato inizialmente testato su un sottogruppo di 41 soggetti provenienti da una coorte più ampia di 98 soggetti. Incorporando un numero maggiore di campioni nella nostra analisi, abbiamo osservato notevoli miglioramenti nei parametri di prestazione della nostra attività di machine learning a tre classi, con un aumento della precisione dall'85% al ​​91% e dal 70% all'84% nelle cinque classi. classificazione di classe per differenziare la gravità della malattia ME/CFS. Questi risultati servono a sottolineare la ripetibilità e la robustezza del nostro algoritmo, rafforzando il nostro approccio di utilizzo di un test diagnostico basato sulle cellule del sangue che combina la spettroscopia Raman a cellula singola e l’apprendimento d’insieme come promettente strumento diagnostico per la ME/CFS.

3 Discussione
In questo lavoro, abbiamo acquisito SCRS di PBMC dal sangue di 98 individui per un test diagnostico di ME/CFS e MS. È stato stabilito un flusso di lavoro dal campione alla diagnosi, che prevede l'isolamento dei PBMC, le misurazioni spettroscopiche Raman, la classificazione dell'apprendimento dell'insieme e la diagnosi finale. Gli SCRS dei PBMC dei controlli sani, dei controlli della ME/CFS e della malattia con SM hanno mostrato caratteristiche distinte e diversi fenotipi sono stati visualizzati come cluster chiari sia a livello di singola cellula che a livello individuale. Nessuna scala FSS, presentazione dei sintomi clinici, né la valutazione della respirazione mitocondriale potrebbero separare le diverse classi di gravità dei pazienti ME/CFS dai pazienti con SM e dai controlli sani, suggerendo la necessità di un test diagnostico semplice e diretto per la malattia. Un punteggio SF-36 pari a 25 è stato utilizzato per separare i gruppi lieve e moderato con una buona separazione mediante microscopia Raman. Studi futuri esploreranno l’uso dei questionari MFI-20 e DSQ che potrebbero potenzialmente migliorare le diagnosi lievi e moderate. Tuttavia, i pazienti possono fluttuare tra stati lievi e moderati, quindi assegnare i pazienti a uno dei due gruppi sarà una sfida.
Quantificando i livelli di metaboliti intracellulari tramite gli spettri Raman delle PBMC, abbiamo osservato differenze metaboliche tra la ME/CFS e due coorti di controllo. La maggior parte dei cambiamenti metabolici che sono stati riportati nei precedenti studi ME/CFS sul plasma sono coerenti con gli effetti diretti e indiretti dello sforzo energetico [ 32 - 36 ] e del metabolismo lipidico anormale. [ 35 - 39 ]I nostri risultati concordano con l’utilizzo alterato degli aminoacidi nei pazienti con ME/CFS, inclusi gli AAA di triptofano, tirosina e fenilalanina. Ciò è stato dimostrato anche nel gruppo con SM rispetto ai controlli sani. È stato osservato un notevole aumento dei livelli di triptofano nei PBMC in tutti i gruppi di malattie, suggerendo potenziali alterazioni nella via della chinurenina e nella biosintesi del NAD. [ 33 ] L’ipotesi di una trappola metabolica [ 40 ]è stato proposto di collegare gli alti livelli di triptofano nelle cellule immunitarie dei pazienti ME/CFS alla loro incapacità di generare chinurenina. Ciò potrebbe essere attribuito a mutazioni nel gene dell'indoleammina 2,3-diossigenasi 2 (IDO2), che portano all'accumulo di triptofano e alla successiva inibizione della produzione di chinurenina attraverso la repressione dell'isoenzima IDO1 più cataliticamente attivo. I nostri dati supportano anche l’osservazione dell’accumulo di triptofano nelle frazioni cellulari PBMC dei pazienti ME/CFS. Tuttavia, è importante considerare che le frazioni PBMC sono costituite da popolazioni cellulari miste, con cellule che esprimono IDO1 e IDO2, comprese le cellule dendritiche mieloidi e plasmacitoidi, che rappresentano solo una piccola percentuale. Le indagini future dovrebbero quindi concentrarsi su specifici tipi di cellule che esprimono IDO1 e IDO2 per ottenere ulteriori approfondimenti.
Studi precedenti hanno anche riportato livelli alterati di triptofano sierico nei pazienti ME/CFS. [ 41 , 42 ] Il triptofano, un amminoacido essenziale con implicazioni significative sull'umore e sull'affaticamento, funge da precursore sia della serotonina che della chinurenina. Livelli ridotti di triptofano nel cervello sono stati fortemente associati all’affaticamento centrale, una caratteristica distintiva sia della ME/CFS che della sclerosi multipla (SM). [ 43 ] Le cellule cerebrali sintetizzano la propria serotonina dal triptofano, [ 44 ]l’accumulo di triptofano nel sistema immunitario potrebbe portare a una ridotta disponibilità e a una diminuzione della sintesi di serotonina nel cervello, contribuendo così all’affaticamento centrale. Al contrario, livelli elevati di triptofano nel sangue potrebbero indicare un aumento della serotonina sierica. Livelli eccessivi di serotonina, come osservato in condizioni come la sindrome da eccessiva serotonina, possono produrre sintomi simili a quelli osservati nella ME/CFS. [ 45 ] Inoltre, livelli elevati di serotonina possono avere effetti dannosi sulla barriera emato-encefalica (BBB), facilitando potenzialmente la neuroinfiammazione che sostiene la progressione della malattia e promuove le ricadute. [ 46 ]Tuttavia, indipendentemente dai meccanismi specifici coinvolti, è fondamentale riconoscere i potenziali effetti disfunzionali del triptofano e della serotonina nel contesto della ME/CFS.
Insieme all'osservazione di livelli ridotti di tirosina in tutti i gruppi di malattie e di fenilalanina ridotta nel gruppo ME grave, i nostri risultati sono coerenti con altri studi sul metabolismo dei pazienti utilizzando l'analisi dei metaboliti ad ampio spettro che hanno indicato livelli anormali di metaboliti in pazienti con livelli ridotti di aminoacidi sierici acidi e disturbi del metabolismo della piruvato deidrogenasi, degli sfingolipidi e dei fosfolipidi. [ 14 , 34 , 35 , 47 ]Elevati livelli di glicerolo sono stati osservati in tutti i sottogruppi del gruppo ME e nel gruppo MS. In combinazione con i livelli alterati di acidi grassi insaturi nei gruppi ME e MS, ciò potrebbe suggerire che la lipolisi sia indotta laddove il glicerolo viene scomposto in acidi grassi liberi, di solito durante periodi di privazione energetica, come il digiuno e l’esercizio fisico. [ 48 , 49 ] L'utilizzo alterato degli acidi grassi e degli aminoacidi suggerisce anche una strategia alternativa per il rifornimento di energia. I livelli di glicogeno e glucosio sono diminuiti nelle cellule di tutti i gruppi di malattie. Un noto meccanismo di affaticamento è il progressivo aumento dei tassi di ossidazione degli aminoacidi muscolari che si verifica dopo l’esercizio continuo, che porta all’esaurimento del glicogeno. [ 50 , 51]  Tuttavia, una singola sessione di attività fisica non è un tipico fattore di stress abbastanza intenso da esaurire le riserve di glicogeno muscolare. [ 52 ] Il glicogeno, oltre a servire come combustibile, svolge anche un ruolo come molecola di segnalazione. Nel complesso, gli effetti causali della deplezione di glicogeno sull’affaticamento non sono ancora chiari. [ 53 ] Sono stati osservati un metabolismo degli acidi grassi alterato e una riduzione del colesterolo e degli esteri del colesterolo. Esistono prove che indicano che i cambiamenti nel metabolismo dei lipidi, come quelli del colesterolo, degli sfingolipidi e degli acidi grassi, hanno un ruolo non solo nell’eziologia delle malattie neurodegenerative come la SM, ma anche come indicatori dell’insorgenza e dello sviluppo della malattia. [ 54 ]L’insolita comunicazione mediata dai lipidi nelle cellule immunitarie è una teoria che potrebbe spiegare l’eziologia della SM. [ 55 ]
Abbiamo esplorato l'uso dell'apprendimento d'insieme per l'identificazione delle cellule in base ai loro spettri Raman. Lo studente insieme ha ottenuto buone prestazioni predittive quando testato tramite un protocollo di suddivisione treno/test ed è stato migliorato in modo significativo combinando algoritmi di apprendimento individuali. Ha raggiunto un tasso di accuratezza del 91% per fare una diagnosi di SM, ME/CFS o non-affaticamento; e un'accuratezza dell'84% con l'identificazione aggiuntiva della gravità della malattia ME. Il metodo di pre-formazione dell'ensemble learner può essere facilmente esteso a nuovi contesti clinici per la diagnosi. Poiché il test è stato effettuato a livello di singola cellula, è necessaria solo una piccola quantità di campione di sangue. Ha anche il vantaggio di poter essere eseguito su materiale fisso senza le limitazioni di un test su cellule vive. Un test semplice e minimamente invasivo mediante l’analisi delle cellule del sangue per la diagnosi delle sindromi da fatica come la ME/CFS nelle cure primarie ha il potenziale di avere un impatto drastico sulla qualità della vita dei pazienti. Di particolare interesse il raggiungimento della sensibilità del 91% e della specificità del 93% per il gruppo ME/CFS mentre, ad oggi, la diagnosi e la valutazione della ME/CFS negli studi di ricerca sono spesso basate su auto-segnalazioni, questionari e misure soggettive, ad esempio, l'affaticamento gravità e impatto.[ 56 ]Uno strumento diagnostico oggettivo, sensibile e diretto può quindi risolvere la controversia riguardante la natura della ME/CFS e fare una differenza significativa nell’impatto medico, economico, sociale ed emotivo della ME/CFS sui singoli pazienti e sulla società. Sebbene l'approccio spettroscopico Raman a cellula singola non sia ancora facilmente disponibile nei laboratori diagnostici certificati, il che potrebbe rappresentare un ostacolo all'adozione, il nostro studio ne indaga il potenziale come tecnica diagnostica nuova di zecca e rapida (misurazione per un campione < 1 h) , accurato (precisione del 91%) e minimamente invasivo, consentendo così un monitoraggio più spesso longitudinale delle malattie.
È stato precedentemente dimostrato che la crioconservazione ha effetti sui marcatori delle cellule immunitarie [ 57 , 58 ] e sulle loro funzioni. [ 59 , 60 ] Contrariamente all'impatto della crioconservazione sulla funzionalità PBMC, l'applicazione della microspettroscopia Raman a cellula singola utilizzando campioni congelati, fissati prima dell'analisi, si è rivelata estremamente efficace, garantendo l'eccellente differenziazione dei gruppi di pazienti con la capacità aggiuntiva per separare i diversi tipi di gravità della ME/CFS. Rispetto ad altri esami del sangue esplorati nella ME/CFS, [ 61 - 63 ]il nostro approccio Raman su campioni PBMC fissi presenta numerosi vantaggi. Una volta preparati, i campioni possono essere conservati in azoto liquido o a –80°C per un periodo di tempo prolungato e la durata del congelamento non ha mostrato un effetto significativo nel contribuire alla classificazione utilizzando il set di dati Raman. Gli studi futuri dovrebbero anche confrontare i PBMC appena fissati con i campioni crioconservati prima della fissazione. Ciò non è stato possibile in questo studio a causa dei campioni ottenuti congelati dalla biobanca ME/CFS UK. L’esame dei campioni appena fissati in futuro costituirebbe una migliore valutazione di come questo approccio potrebbe essere utilizzato clinicamente come test diagnostico.
L'esame delle funzioni mitocondriali o energetiche delle PBMC si è dimostrato promettente come test per le PBMC. Tuttavia, i risultati variano da un laboratorio all’altro, con i notevoli problemi incontrati durante lo sviluppo di un test su cellule vive, come le attività a bassa energia delle cellule. La possibilità di utilizzare PBMC fissi è un vantaggio importante che consente di conservare facilmente i campioni prima dell'analisi. La natura unicellulare dell'approccio spettroscopico Raman richiede solo un piccolo campione di sangue che potrebbe essere sviluppato come test point-of-care, magari da una goccia di sangue. Se fosse possibile identificare differenze nel plasma o nel siero, questo approccio fornirebbe un campione facile da generare e si potrebbe ottenere un risultato molto più rapido. In futuro, anche l’implementazione pratica di questo test diagnostico potrà trarre vantaggio da questi vantaggi. Per ragioni di costo e di spazio, dotare ogni laboratorio comunitario del necessario microscopio Raman potrebbe non essere un approccio fattibile. Tuttavia, raccogliendo campioni localmente e successivamente fissandoli e trasferendoli in centri selezionati in grado di condurre i test Raman, è possibile ottenere una più ampia disponibilità del test diagnostico. In alternativa, si potrebbe sviluppare un sistema compatto contenente strumenti Raman portatili, che sarebbe molto più economico di un microscopio Raman standard, e incorporato con sistemi microfluidici per far passare le cellule attraverso un laser Raman per il rilevamento, eliminando la necessità di una lunga elaborazione dei campioni di sangue. è possibile ottenere una più ampia disponibilità del test diagnostico. In alternativa, si potrebbe sviluppare un sistema compatto contenente strumenti Raman portatili, che sarebbe molto più economico di un microscopio Raman standard, e incorporato con sistemi microfluidici per far passare le cellule attraverso un laser Raman per il rilevamento, eliminando la necessità di una lunga elaborazione dei campioni di sangue. è possibile ottenere una più ampia disponibilità del test diagnostico. In alternativa, si potrebbe sviluppare un sistema compatto contenente strumenti Raman portatili, che sarebbe molto più economico di un microscopio Raman standard, e incorporato con sistemi microfluidici per far passare le cellule attraverso un laser Raman per il rilevamento, eliminando la necessità di una lunga elaborazione dei campioni di sangue.
Nel prossimo decennio, i progressi nelle tecnologie sanitarie e una maggiore attenzione alla prevenzione, alla diagnosi precoce e al benessere porteranno importanti miglioramenti nei risultati dei pazienti. In condizioni croniche inspiegabili come la ME/CFS, l’utilizzo di dati complessi e approcci di apprendimento automatico sarà di grande importanza non solo nella diagnosi ma anche nella definizione delle fasi iniziali delle condizioni in cui il paziente non mostra alcun sintomo o ne mostra pochi. Ciò aiuterà a stabilire nuovi approcci terapeutici legati a sottili cambiamenti nella biologia del paziente, prevenendo lo sviluppo di una malattia conclamata, che è più difficile da trattare una volta instaurata. L’analisi predittiva basata sulla prognosi automatica, uno strumento che generalizza i punteggi di rischio utilizzando algoritmi di apprendimento automatico, è già stata testata in numerosi contesti clinici. [ 64 ]Per quanto ne sappiamo, insieme al nostro studio pilota, questa è la prima ricerca che utilizza la spettroscopia Raman e tecniche avanzate di apprendimento automatico per discriminare sottogruppi di pazienti ME/CFS in base alla gravità dei sintomi, ottenuta con elevata accuratezza, sensibilità e specificità.
Con sofisticati algoritmi di apprendimento automatico, il nostro approccio spettroscopico Raman ha un grande potenziale come tecnica diagnostica per malattie come la ME/CFS.
Inoltre, il nostro approccio potrebbe essere trasferibile ad altre condizioni croniche simili, come la sclerosi multipla (SM), la fibromialgia, la malattia cronica di Lyme e il Long Covid. Le condizioni indotte da un singolo fattore di stress, come la malattia cronica di Lyme e il Long Covid, possono differire dalla ME/CFS e dalla fibromialgia, che sono associate a fattori di stress multiformi. Queste distinzioni potrebbero comportare la manifestazione di caratteristiche uniche accanto a modelli comuni. Riconoscere e delineare queste differenze migliorerebbe la precisione diagnostica e consentirebbe l’implementazione di interventi su misura, portando in definitiva a risultati migliori per i pazienti. Con i piani in corso di espandere le dimensioni della nostra coorte attraverso collaborazioni con partner industriali per generare set di dati indipendenti per la convalida e coinvolgere altre coorti di pazienti con comorbilità simili, il nostro approccio mostra un potenziale significativo come strumento diagnostico per varie malattie croniche inspiegabili. Incorporando tecniche complementari come la metabolomica e la proteomica, possiamo ampliare ulteriormente la nostra comprensione di queste malattie e potenzialmente identificare potenziali biomarcatori e scoprire meccanismi patologici condivisi tra queste condizioni croniche.

4 Sezione Sperimentale

Etica
Questo studio è stato approvato dai comitati etici della ricerca dell'Università di Oxford (numero di riferimento: R51826/RE001) e dall'UCL Biobank Ethical Review Committee-Royal Free (B-ERC-RF) London NHS Foundation Trust (numero di riferimento: EC. 2017.012). L'approvazione etica per la raccolta e l'archiviazione di campioni e dati è stata concessa dal Comitato etico della London School of Hygiene & Tropical Medicine (LSHTM) (Rif. 6123) e dal Comitato etico della ricerca di Londra-Bloomsbury del National Research Ethics Service (NRES) (REC rif. 11 /10/1760, ID IRAS:77 765). I campioni sono stati forniti dalla Biobanca britannica ME/CFS (UKMEB) in conformità con un accordo di trasferimento di materiale firmato dalla London School of Hygiene & Tropical Medicine e dall’Università di Oxford.


Elaborazione PBMC
Le PBMC sono state ottenute dalla ME/CFS Biobank London School of Hygiene & Tropical Medicine del Regno Unito e conservate a -80 °C fino al momento dell'uso. I campioni PBMC utilizzati sono stati elaborati secondo il protocollo UCL-RFH Biobank (BB/SOP/007/01) dal personale del laboratorio UCL-RFH Biobank. Il processo comprende la diluizione con HBSS sterile, la separazione mediante centrifugazione utilizzando Lympholyte come mezzo e l'isolamento delle cellule mononucleari che vengono pellettizzate dopo un'ulteriore centrifugazione. I campioni sono stati conservati da 1 a 5 anni presso la Biobanca in serbatoi di azoto liquido.

Saggi del tasso di consumo di ossigeno (OCR).
Le cellule sono state delicatamente scongelate e contate utilizzando Trypan Blue. Per l'analisi del tasso di consumo di ossigeno (OCR), 500.000 cellule per pozzetto sono state piastrate in piastre nere da 96 pozzetti. La sonda di rilevamento dell'ossigeno MitoXpress Xtra (Agilent) è stata aggiunta secondo le istruzioni del produttore, utilizzando olio minerale ad alta sensibilità (HS) riscaldato. Le piastre sono state lette dal lettore di piastre ClarioStar (BMG Labtech) in modalità fluorescenza risolta in tempo utilizzando il filtro Ex TR-ex (340 nm) ed Em TR-em (650 nm), a 37 °C. L'OCR è stato calcolato utilizzando il software MARS (BMG Labtech). Per le misurazioni microspettroscopiche Raman, 5000 cellule sono state lavate in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e fissate in paraformaldeide al 4% (PFA) per 15 minuti, quindi lavate con PBS, centrifugate e i pellet risospesi in PBS, conservati a 4°C. C fino all'analisi.


Misurazioni degli spettri Raman a cella singola (SCRS)
In questo studio le misurazioni spettroscopiche Raman sono state eseguite in cieco. Al ricevimento, le cellule fissate con PFA sono state lavate due volte con dH2O per rimuovere tracce di mezzo o sostanza chimica. Quindi 2 µl di ciascun campione sono stati fatti cadere su un vetrino microscopico rivestito di alluminio per essere asciugato all'aria. Gli spettri Raman sono stati acquisiti utilizzando un microscopio Raman confocale HR Evolution (Horiba Jobin-Yvon, UK Ltd) dotato di un laser a granato di alluminio al neodimio-ittrio da 532 nm. La potenza del laser sulle celle era di 5 mW, attenuata utilizzando filtri a densità neutra. Per mettere a fuoco le singole cellule è stato utilizzato un obiettivo aereo (50×, NA = 0,65). La diffusione Raman dal punto focale è stata rilevata da un dispositivo ad accoppiamento di carica (CCD) raffreddato a -70 °C. Gli SCRS sono stati misurati da 320 a 3400 cm -1con griglia da 300 cave per mm. È stata utilizzata una modalità di mappatura per caratterizzare le singole cellule e i parametri di acquisizione erano 5 s per spettro. Poiché ciascuna cella aveva una dimensione di ≈3–10 µm 2 dopo l'essiccazione all'aria, sono stati misurati 5–10 spettri per cella e ≈30 singole cellule per ciascun gruppo. Dopo il controllo di qualità per rimuovere gli spettri con bassi rapporti segnale-rumore, le misurazioni di 98 campioni hanno prodotto un numero totale di 14.600 spettri Raman da 2.155 singole cellule. Gli spettri di ciascuna cella sono stati quindi mediati in SCRS.

Modello di classificazione dell'apprendimento d'insieme
L'SCRS è stato suddiviso in un convoglio e un set di prova con un rapporto di suddivisione 0,8:0,2. Sia il treno che i set di test contenevano un numero bilanciato di campioni provenienti da cinque gruppi di SM, ME grave, ME moderata, ME lieve e HC. Mentre il set di treni è stato utilizzato per addestrare un modello di classificazione, il set di test è stato utilizzato per valutare in modo indipendente le prestazioni del modello. È stato utilizzato un approccio di convalida incrociata per consentire a tutti i campioni di entrare nel set di test indipendente almeno una volta, sfruttando quindi al meglio il pool di campioni. Le misurazioni finali delle prestazioni sono state riportate in base alle medie di tutti i risultati della convalida incrociata. La pre-elaborazione degli spettri Raman grezzi prevedeva il ridimensionamento, la centratura e la riduzione delle dimensioni mediante l'analisi delle componenti principali fino alle prime cento componenti principali.S5 , Informazioni di supporto). Durante la costruzione del modello è stata utilizzata una validazione incrociata dieci volte con cinque ripetizioni. Dopo aver stabilito e valutato i modelli di classificazione basati sugli otto classificatori, otto modelli sono stati impilati insieme per creare un insieme di studenti a due livelli per un migliore risultato di classificazione. I risultati della previsione del set di test degli otto modelli sono stati utilizzati come caratteristiche per lo studente insieme che ha utilizzato un GBM. Tutti i modelli sono stati costruiti in un ambiente R 4.0.0.

Analisi statistica
Le statistiche descrittive (mediana e intervallo) sono state calcolate per riassumere le variabili sociodemografiche. Tutte le variabili cliniche continue sono state analizzate utilizzando test non parametrici bilaterali per campioni indipendenti; Test della somma dei ranghi di Wilcoxon con correzione di continuità (Mann Whitney U), con variabili categoriali confrontate utilizzando il test esatto di Fisher.
La presenza e l'intensità dei sintomi sono state determinate per 63 variabili ottenute dalla valutazione dei sintomi dell'UKMEB. Le risposte sono state registrate su una scala ordinale a 4 punti, per tutti e tre i gruppi (HC, MS, ME), dove 0 indicava "assente", 1 indicava "lieve", 2 indicava "moderato" e 3 indicava "grave". Le variabili erano formulate come “Hai avuto vertigini in piedi?”, o “Hai avuto confusione/annebbiamento cerebrale?”. I dati clinici sono stati analizzati utilizzando la versione R 4.0.2. Le mappe di calore sono state create utilizzando il pacchetto ggplot2.
Tutti gli spettri Raman sono stati preelaborati mediante correzione dei raggi comici, adattamento della linea di base della polilinea e normalizzazione vettoriale dell'intera regione spettrale. L'analisi dei dati, le statistiche e la visualizzazione sono state eseguite in un ambiente R (4.0.0). La quantificazione delle biomolecole intracellulari è stata effettuata integrando le corrispondenti bande Raman nella SCRS. Le bande Raman sono state integrate a 758, 880, 1013 e 1550 cm −1 e 1022–1036 cm −1 per quantificare il triptofano; 1003 e 1032 cm −1 per quantificare la fenilalanina; 642, 830 e 850 cm −1 per quantificare la tirosina. I risultati della quantificazione sono stati rappresentati come box plot e le medie dei campioni sono state confrontate con il controllo sano (HC) utilizzando il t -test a due campioni di Welch per una varianza disuguale.

Ringraziamenti
Questo progetto di ricerca è stato sostenuto da una sovvenzione del progetto della ME Association a KM. Gli autori ringraziano la professoressa Antonyia Georgieva e il dottor Jonathan Williams per aver esaminato criticamente questo manoscritto. WEH riconosce il supporto di EPSRC (EP/M002403/1 e EP/M02833/1). Ringraziamo anche l'Istituto di ingegneria e tecnologia biomedica di Suzhou, Accademia cinese delle scienze per il sostegno finanziario.

Conflitto d'interesse
Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interesse.

Contributi dell'autore
JX, KJM e WEH hanno contribuito alla concettualizzazione. JX e KJM hanno scritto la bozza originale. Tutti gli autori hanno contribuito alla revisione e alla modifica del manoscritto finale. JX ha eseguito modelli di acquisizione, analisi e machine learning di dati Raman. TL ha effettuato gli esperimenti mitocondriali e l'elaborazione dei campioni. CK ed EL hanno reclutato pazienti, elaborato campioni di sangue e supportato l'analisi clinica. JS ha effettuato le statistiche cliniche e la modellazione. JM ha sostenuto la componente SM dello studio e l'ha incorporata in uno studio più ampio. SK e PZ hanno supportato l'interpretazione delle valutazioni cliniche.